公众号
微信

扫一扫关注微信公众号

细胞生物学平台电镜机组常规透射电镜样品处理有哪些步骤和注意事项?
2016/02/017986

一、步骤:

1. 取新鲜的足够小的样品立刻置于pH=7.2的固定液(含2%PFA和2.5%的戊二醛的混合液)中,4°C过夜或者室温固定2h以上。
2. 0.1M的PB缓冲液冲洗样品3次,10min/次。
3. 1%饿酸后固定1h。
4. 0.1MPB缓冲液冲洗3次,10min/次。
5. 梯度酒精脱水,50%,70%,80%,90% 10min,100%酒精3次,10min/次。
6. 酒精:丙酮=1:1   10min。
7. 丙酮  10min。
8. 丙酮:812树脂 =1:1  2h,RT
9. 丙酮:812树脂 =1:2  2h,RT
10. 丙酮:812树脂 =1:3  2h,RT
11. 树脂过夜。
12. 更换新鲜树脂8h。
13. 包埋样品,RT静置4h。.
14. 37°C过夜。
15. 60°C24h。
16. 制作超薄切片。
17. 电镜观察拍照。
二、注意事项:
1. 如有条件对实验动物用混合固定液((含2%PFA和2.5%的戊二醛的混合液)进行灌流(perfusion fixation),或者在低温环境下用锋利的切割器械迅速取材。
2. 动作迅速:组织离体后应尽快将其快速放入化学固定液内,使组织和细胞尽可能保持原来的生活状态。
3. 减少损伤:选择锋利切割器械,避免或尽量减少牵拉或挤压组织。
4. 组织块大小:为使组织得到均匀而充分固定,所取材料应小于1mm³。
5. 低温操作:为减少对组织细胞酶活性的破坏,最好在4℃下操作,所用容器、器械及固定液均需要预冷。在血液供给停止后,防止组织和细胞内各种酶的作用使组织发生自溶,降解组织中蛋白、核酸等主要成分。
6. 需要定位样品请与相关人员咨询特定取材方式。
常见样品脱水时间:
细胞8min
组织10min,若较嫩为8min
细胞器2min
脂肪8min或<8min
叶片15min
根15min
藻类15min
菌10-15min
以上均为常规注意事项,送样之前和送样时请与相关人员当面进行沟通,然后选择适合的处理方法。


返回列表
预约登录
联系我们