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相分离中的光学显微镜成像技术
2018/12/24108

作者:曹慧珍 

“相分离”物理化学领域中的基本概念,这一现象可追溯至鸿蒙初始,盘古开天辟地,清者上升为天,浊者下沉为地。“相分离”也是生物学研究领域的热词,CNS2018年已发表多篇相关报道。细胞中的相分离,细胞内特定分子聚集起来形成液滴形成特定环境加速生物学反应,具有重要的生物学意义。小编不是科研工作者,就不班门弄斧给大家科普“相分离”的重要意义了,大家可以去查阅相关文献。小编是显微镜工作人员哦,可以给大家提供相分离结构研究过程中显微镜图像采集的技术支持!

1. 相分离的基础----确定蛋白质形成液滴的浓度以及液滴的尺寸
这也是显微镜成像中的基础篇哦,设置好成像光路(根据蛋白的荧光标记+TD),采集不同浓度样品的荧光和透射光成像即可。

1.1选择物镜(根据物镜型号确定是否加油加水),点击OC在显微镜目镜下确认样品位置和焦面。 

*相变的尺寸是微米级的,所以通常情况下直接选择60X或100X油镜;但对于初学者或者底部厚度>0.17mm的器皿,选择20X物镜,通过zoom后续放大。 

1.2点击A1切换至共聚焦显微镜成像,点击[Laser Inter Locked]按钮,解除闪烁状态,使激光可以通过软件解除锁定。 

1.3点击打开光路设置窗口

1.4勾选需要的通道(根据蛋白标记的荧光信号),如果观察多种蛋白相分离,根据不同蛋白标记勾选多个通道,点击按钮,透射光检测器进入光路,同时获取透射图像。 

*多通道图像采集时,需注意通道顺序Ch Series,为避免串色,建议选择line41顺序采集模式,如多色荧光相互之间确定不会串色,可选择none模式,提高采集速度。 

1.5在Pinhole的项目中点击[▲Home]按钮,选择与物镜最匹配的针孔尺寸。 

1.6调整像素数为所需要的分辨率(512×512或1024×1024等),选择扫描速度(信号较弱时,可降低扫描速度,提高信号亮度)。 

1.7点击[Live]按钮,先调节至最佳焦面,然后边观察图像边调节激光功率和检测器的灵敏度HV。 

*提高Laser和HV都可提升图片亮度,但HV过高,噪音增加,信噪比会降低,Laser过高,会带给样品光毒性,不利于多次图像采集,请根据实验目的,合理调整Laser和HV获得最佳成像效果。 

1.8根据需要选择Average,提升信噪比。 

1.9点击[XY]按钮以获取图像。 

1.10菜单栏中选择[File] -> [Save As]保存图像。

2. 液滴融合或分离实验 

timelapse时间序列图像采集

2.1重复1.1-1.6 

2.2打开PFS完美聚焦系统,较正热漂移带来的焦面变化,保证长时间拍摄焦面稳定性。 

2.3点击[Live]按钮,先调节至最佳焦面,然后边观察图像边调节激光功率和检测器的灵敏度HV。 

2.4根据需要选择Average,提升信噪比。 

2.5进入ND Acquisition窗口,勾选T 

2.6设置时间间隔(Interval)和持续时间(Duration),Interval需大于单张图像采集时间。 

2.7勾选[Save to File],在采集图像的同时保存图像。 

2.8点击[Run now]按钮,获取时间序列图像。 

*若液滴运动速度较快,可将Interval设置为no delay,并可通过降低图像分辨率和不选择Average保证采集速度尽量大。 

*若液滴容易淬灭,保证亮度信噪比的同时尽量降低激光强度,对于运动较慢的液滴可以设置较长的Interval间隔来降低采图对于荧光染料的淬灭。 

Nott, T. J. et al.

3. 细胞或离体环境中液滴的分布 

三维序列图像采集

3.1重复1.1-1.8 

3.2进入ND Acquisition窗口,勾选Z 

3.3点击[Live]按钮,边预览边调节焦面至信号消失,点击[Top]按钮,确定三维图像的顶面 

3.4继续预览,反方向调节焦面,信号增强再减弱至消失,点击[Bottom]按钮,确定三维图像底面,停止预览。 

3.5输入Step,建议选择推荐值的1-2倍。 

3.6勾选[Save to File],在采集图像的同时保存图像。 

3.7点击[Run now]按钮,获取三维序列图像。 

3.8点击[Show Volume View]按钮,构筑三维图像。用鼠标拖动三维图像的边框,以调节到所需的角度。从菜单栏中执行[Edit] -> [Create View Snapshot (8bit RGB)],获取特定角度的图像。
3.9点击[Show Movie Maker]按钮,开始创建旋转图像,旋转拖拉右侧各种旋转模块进入时间轴,然后点击[Create Movie]按钮创建影像。从菜单栏中选择[File] -> [Save As]将创建的动画保存为avi。

4. 通过FRAP实验研究相分离结构与周围环境的物质交换 

4.1重复1.1-1.6 

4.2打开PFS完美聚焦系统,较正热漂移带来的焦面变化,保证长时间拍摄焦面稳定性。 

4.3点击[Live]按钮,先调节至最佳焦面,然后边观察图像边调节激光功率和检测器的灵敏度HV。 

4.4点击图像侧面边框上的按钮,在图像上绘制ROI。 

4.5在ROI上鼠标右击,从弹出的菜单中选择[Use as Stimulation ROI]。

4.6点击Photo Activation,切换设定画面。选择刺激用的激光及激光功率,选择刺激的扫描速度。 

4.7点击 [Photo Activation]按钮,启动ND Stimulation窗口。

4.8在ND Stimulation窗口设置FRAP程序,通常我们先添加一条采集程序,采集2-3张漂白前的图像(no delay),然后增加一条刺激程序,该程序的ROI编号需于4.5中一致,最后我们添加一或多条采集程序(采集漂白后恢复图像),Interval和Duration取决于液滴荧光的恢复速度及抗淬灭能力。 

4.9点击[Apply Stimulation Settings]按钮,读取光刺激成像的设定。可勾选[Perform Time Measurement]在获取图像的同时获取ROI内荧光信号的时间序列变化图。 

4.10点击 [Run now]按钮,执行光刺激成像,获取FRAP图像。 

*FRAP实验不是一蹴而就的,整个ND stimulation包含三条及以上程序,#1是约定俗成的采集2-3张图像,记录漂白前的图像,#2和#3都是需要不断尝试的。 

#2决定了样品能否被漂白,漂白到什么程度,#3反映了漂白区域的荧光信号恢复速度。在没有相关实验参考的前提下FRAP图像采集建议: 

a) 按照以下程序run:刺激用激光功率先设定为100%,刺激速度1s/f,#1 acquisition  no delay 2 loops,#2 stimulation S1 no delay 1 loops,#3 acquisition  no delay 2 loops。 

b) 根据上述结果图像,判断ROI区域是否被漂白,漂白效率是多少,漂白区域是否与ROI区域匹配。若未被漂白或漂白效率不足50%,需提高漂白时间,通过提高Scan speed或#2中loops都可;若漂白效率高于95%或漂白区域大于ROI区域时,需降低刺激时间或刺激光的强度,因#2中loops为1仅可通过降低Scan speed降低漂白时间;多次测试后获取最佳漂白参数。 

c) 修改#3, acquisition  no delay  duration5min,采集一组图像,判断样品信号的恢复速度以及抗淬灭能力。若样品恢复速度非常快,10s内需要调整Scan setting,牺牲一部分图像分辨率以最快的速度采集图像;若样品恢复速度较慢,可设置interval,减少光毒性和数据量;若信号的恢复速度慢且易淬灭,首先需要调整Acquisition参数,降低Laser提高HV,然后必须提高Interval间隔时间。 

d) 如想一次性漂白多个区域,建议ROI分别Use as Stimulation ROI 1、2、3而非都Use as Stimulation ROI 1,如果使用后者无法使用一个ROI摸索出的漂白参数,漂白效果未知,还需注意在Photo Activation窗口下勾选all stimulation area set to same,#2中ROIs选择S1,S2,S3。

Sun D, Wu R, Zheng J, Li P, Yu L. Cell research 2018;28:405-15.采集自本平台


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