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利用流式细胞仪测细胞凋亡(Apoptosis) Annexin V/PI染色法
2020/06/02134

工作原理:

正常细胞的表面由不对称分布在质膜内叶和外叶上的脂质组成。这些脂质之一磷脂酰丝氨酸(PS),通常仅分布于质膜的内叶,因此仅暴露于细胞质中。然而,在细胞凋亡过程中,脂质不对称性消失并且PS暴露在质膜的外部小叶上。 Annexin V是一种36 kDa的钙依赖性的磷脂结合蛋白,能够与PS结合。因此,荧光标记的Annexin V可用于检测暴露于早期凋亡细胞外部的PS。Annexin V还可以染坏死细胞,因为这些细胞的膜破裂,使Annexin V可以进入整个质膜,但是Annexin V就无法区分坏细胞死(中晚期凋亡细胞)和早期凋亡细胞。因此,通过与碘化丙啶(PI)共染色,可以将凋亡细胞与坏死细胞(中晚期凋亡细胞)区分开,因为早期凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整,PI能进入坏死细胞(中晚期凋亡细胞)但是被早期凋亡细胞排除在外。该方案描述通过Annexin V结合和PI摄取,然后通过流式细胞仪检测和量化凋亡细胞。

Annexin V/PI染色方法:

1)根据细胞类型,选择合适的细胞板接种培养目的细胞;

2)用细胞毒性刺激物处理细胞或通过紫外线辐射触发贴壁细胞死亡,使用明场显微镜观察细胞;

3)收集细胞,将1 × 105个细胞重悬于200μL Binding Buffer中,加入4μL 0.5 mg/mL PI和2μL Annexin V-FITC溶液;

4)避光室温孵育15min;

5)用流式细胞仪进行荧光检测。(Annexin V-FITC最大激发光为488 nm,发射光为520 nm。PI最大激发光为~535 nm,发射光为 617 nm。 但是,两者都可以被488 nm激光激发。)

流式细胞术检测:


通过Annexin V结合和PI摄取来测量细胞死亡。(A)以漫画形式描述凋亡细胞Annexin V结合和PI摄取。(i)磷脂酰丝氨酸(PS)位于活细胞完整质膜的内部小叶上,这些细胞不会被Annexin V和PI染色。(ii)PS翻转到凋亡细胞质膜的外部小叶,这些细胞在外部结合Annexin V,但仍不被PI染色。(iii)继发性坏死细胞(中晚期凋亡细胞)膜破裂, Annexin V与质膜上的PS结合,PI被吸收并与DNA结合。(B)在流式数据的点图中(左侧)以及在用放线菌素D(1μM)处理16 h并用Annexin V染色的U937细胞的点图中观察到i,ii和iii中的种群的地方Annexin V-FITC和PI(右侧)。

实验过程中的小建议(大作用):

1) 要准备阴性对照(不加染料)、阳性对照(同时加两种染料)和单染样品(分别只加一种染料),阳性对照和单染样品细胞可以55℃水浴10min或用凋亡诱导剂诱导细胞凋亡

2) 细胞凋亡检测的是活细胞,切勿用甲醛固定,尽量避免酶消化时间过长或用力吹打产生细胞碎片,重悬细胞后尽快上机检测。

3) Annexin V的结合依赖于钙离子,所以消化液中避免含有EDTA,否则会影响Annexin V与PS的结合。

4) Annexin V的结合不稳定,所以需要在标记时确保使用含钙离子的缓冲液,并且在半小时内上机检测。

5) 如果细胞本身表达GFP或转染了表达GFP的质粒,就会干扰FITC荧光信号,需选择其他荧光标记的Annexin V,如Annexin V-PE,并且染色过程注意避光操作。


1)


右上象限(晚期凋亡)和右下象限(早期凋亡)中的H9c2细胞是凋亡细胞。上图数据中表明,LPS组中H9c2细胞的凋亡率为27.5±0.56%,与对照组相比显著增加(P <0.05)。 此外,在LPS + Gfi-1组中,转染Gfi-1后,LPS诱导的H9c2细胞凋亡率降低了(12.3±0.37%),与LPS组的凋亡率相比明显降低(P <0.05)。 这些数据强烈表明Gfi-1能减弱LPS诱导的H9c2细胞凋亡。

文献链接:DOI: 10.1007/s10753-019-01095-x

2)


流式细胞仪分析用奥沙利铂(抗肿瘤药)处理48 h的HGC-27细胞在有或没有转染miR-374a-5抑制剂的时下细胞凋亡情况。上图数据表明,与对照组(4.69%±0.24%)相比,抑制miR-374a-5p明显诱导了细胞凋亡(9.42%±0.85%)。(Mock:未处理细胞;INC:抑制剂阴性对照;inhibitor:miR-374a-5p 抑制剂)

文献链接:DOI:10.1016/j.omth.2019.07.025

3)


Annexin V

凋亡样本两色分析测定数据。右下象限中的细胞处于凋亡早期,右上象限中的细胞处于凋亡晚期,通常在测定时主要关注这两个象限。(A)用抗Fas抗体(未用PI染色)处理过夜的Jurkat细胞。(B)Jurkat细胞用抗Fas抗体处理过夜,并用PI染色。(C)Jurkat细胞用抗Fas抗体处理过夜并用Annexin V染色。(D)Jurkat细胞用抗Fas抗体处理过夜并用Annexin V和PI染。(E)除了在1mM EDTA存在下进行染色以外,其他与D相同,说明EDTA影响了Annexin V与PS结合。

文献链接:DOI: 10.1101/pdb.top093773


参考文献

1. Crowley L C, Marfell B J, Scott A P, et al. Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry[J]. Cold Spring Harb Protoc, 2016.

2. Wallberg F, Tenev T, Meier P. Analysis of Apoptosis and Necroptosis by Fluorescence-Activated Cell Sorting[J]. Cold Spring Harb Protoc, 2016.

3. Duensing T D, Watson S R. Assessment of Apoptosis (Programmed Cell Death) by Flow Cytometry[J]. Cold Spring Harb Protoc, 2018.

4. Zheng Y, Li S, Hu R, et al. GFI-1 Protects Against Lipopolysaccharide-Induced Inflammatory Responses and Apoptosis by Inhibition of the NF-kappaB/TNF-alpha Pathway in H9c2 Cells[J]. Inflammation, 2019.

5. Ji R, Zhang X, Gu H, et al. miR-374a-5p: A New Target for Diagnosis and Drug Resistance Therapy in Gastric Cancer[J]. Mol Ther Nucleic Acids, 2019, 18: 320-331.

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